Федеральное агентство по образованию

Бийский технологический институт (филиал)

государственного образовательного учреждения

по курсам «Общая биология и микробиология», «Микробиология» для студентов специальностей 240901 «Биотехнология»,
260204 «Технология бродильных производств и виноделие»
всех форм обучения

УДК 579.118:579.22

Каменская, микроорганизмов: методические рекомендации к лабораторным работам по курсам «Общая биология
и микробиология», «Микробиология» для студентов специальностей 240901 «Биотехнология», 260204 «Технология бродильных произ-водств и виноделие» всех форм обучения / ,
.

Алт. гос. техн. ун-т, БТИ . – Бийск:

Изд-во Алт. гос. техн. ун-та, 2007. – 36 с.

В настоящих методических рекомендациях рассматриваются основные понятия, правила и принципы классификации и идентификации микроорганизмов. Приводится лабораторная работа по изучению различных свойств бактерий, необходимых для описания бактериального штамма и идентификации его до уровня рода.

Рассмотрены и одобрены

на заседании кафедры

«Биотехнология».

Протокол № 88 от 01.01.2001 г.

Рецензент:

д. б.н., профессор, БПГУ им.

© БТИ АлтГТУ, 2007

1 ОСНОВНЫЕ ПОНЯТИЯ И ПРАВИЛА НАИМЕНОВАНИЯ

МИКРООРГАНИЗМОВ

Описано несколько тысяч видов микроорганизмов, однако считают, что это составляет менее 1 % от реально существующих. Изучение разнообразия микроорганизмов составляет предмет систематики. Основной ее задачей является создание естественной системы, отражающей филогенетические взаимоотношения микроорганизмов. До последнего времени систематика микроорганизмов базировалась преимущественно на фенотипических признаках: морфологических , физиологических, биохимических и др., поэтому существующие системы классификации носят в значительной степени искусственный характер. Однако они позволяют сравнительно легко идентифицировать некоторые вновь выделенные штаммы микроорганизмов.

Систематика включает такие разделы, как классификация, номенклатура и иден тификация . Классификация определяет порядок помещения индивидуумов, обладающих заданной степенью однородности, в определенные группы (таксоны). Номенклатура представляет собой свод правил наименования таксонов. Идентификация означает определение принадлежности изучаемого организма к тому или иному таксону.

Термин «таксономия» часто используют как синоним систематики, однако иногда под ним понимают раздел систематики, включающий теорию классификации, учение о системе таксономических категорий, границах и соподчинении таксонов. Основной таксономической категорией в микробиологии, как и в других биологических науках, является вид - совокупность особей, характеризующихся рядом общих морфологических, физиолого-биохимических, молекулярно-генетических признаков.

Под термином «штамм» понимают чистую культуру микроорганизма, выделенную из определенного места обитания (воды, почвы, организма животного и т. д.). Разные штаммы одного вида микроорганизмов могут различаться по некоторым признакам, например, чувствительности к антибиотикам , способности синтезировать некоторые продукты метаболизма и т. д., но эти различия меньше, чем видовые. Понятие «штамм» в микробиологии и генетике несколько различаются: в микробиологии это понятие является более широким. Виды микроорганизмов объединяют в таксономические категории более высокого порядка: роды, семейства, порядки, классы, отделы, царства. Эти категории называют обязательными. Предусмотрены также необязательные категории: подкласс, подпорядок, подсемейство, триба, подтриба, подрод, подвид. Однако в систематике необязательные категории используются довольно редко.

Номенклатура микроорганизмов подчиняется международным правилам. Так, имеется Международный кодекс номенклатуры бактерий. Для дрожжевых грибов основным руководством является «The Yeasts. A Taxonomic Study», для мицелиальных грибов и водорослей – Международный кодекс ботанической номенклатуры.

Для наименования объектов в микробиологии, как в зоологии и ботанике, используют бинарную или биноминальную (от лат. bis – дважды) систему номенклатуры, в соответствии с которой каждый вид имеет название, состоящее из двух латинских слов. Первое слово означает род, а второе определяет конкретный вид этого рода и называется видовым эпитетом. Родовое название всегда пишется с заглавной буквы, а видовое – со строчной даже в том случае, если видовой эпитет присвоен в честь ученого, например Clostridium pasteurianum . В тексте, особенно с латинской графикой, все словосочетание выделяют курсивом. При повторном упоминании названия микроорганизма родовое название можно сократить до одной или нескольких начальных букв, например С. pasteurianum . Если в тексте встречаются названия двух микроорганизмов, которые начинаются с одной и той же буквы (например, Clostridium pasteurianum и Citrobacterfreundii ), то сокращения должны быть разными (С. pasteurianum и Ct . freundii ). Если микроорганизм идентифицирован только до рода, вместо видового эпитета пишут слово sp. (species – вид), например Pseudomonas sp. В этом случае при повторном упоминании названия микроорганизма в тексте родовое название следует всегда писать полностью.

Для наименования подвида используют словосочетание, состоящее из названия рода, а также видового и подвидового эпитетов. Для разграничения этих эпитетов между ними пишут буквенное сочетание, представляющее собой сокращенное слово subspecies – «subsp.» или (реже) «ss.». Например, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus .

Для каждого штамма указывают также аббревиатуру названия коллекции культур микроорганизмов, в которой он хранится, и номер, под которым он там значится. Например, Clostridium butyricum АТСС 19398 означает, что штамм хранится в американской коллекции типовых культур (American Type Culture Collection, АТСС) под номером 19398. Список коллекций микроорганизмов, пользующихся мировой известностью, приводится в «Руководстве Берджи по систематике бактерий» (Bergeys Manual of Systematic Bacteriology, 1984–1989), в каталогах культур микроорганизмов и других справочных изданиях.

Описание любого нового вида микроорганизмов базируется на типовом штамме, который хранится в одной из коллекций микроор-ганизмов и на основании совокупности свойств которого данный вид

характеризуется в оригинальной статье или определителе. Типовой штамм является номенклатурным типом вида, поскольку за ним закреплено видовое название. Если какие-либо штаммы, первоначально включенные в тот же вид, в дальнейшем будут признаны заслуживающими выделения в особые виды, они должны получить новые названия, а старое видовое название сохраняется за типовым и родственным ему штаммами. При этом номер переименованного штамма сохраняется прежним. Аутентичными называют штаммы, полностью совпадающие по своим свойствам.

Для рода номенклатурным типом является специально обозначенный типовой вид, обладающий набором наиболее характерных для представителей данного таксона признаков. Например, в роде Bacillus типовым видом является В. subtilis .

В некоторых определителях и каталогах указывают старые названия переименованных микроорганизмов, а также приводят фамилии авторов, которые первыми выделили данный микроорганизм, и год публикации, в которой впервые описан этот организм. Например, один из видов дрожжей указывается в каталоге Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ) как Candida magnoliae (Lodder et Kreger van Rij, 1952) Meyer et Yarrow 1978, BKM Y-1685. Это означает, что он впервые был описан Lodder и Kreger van Rij в публикации 1952 г., тогда этот вид был назван Torulopsis magnoliae . В 1978 г. Torulopsis magnoliae был переименован такими исследователями, как Meyer и Yarrow, в Candida magnoliae и хранится в настоящее время в ВКМ под номером ВКМ Y-1685. Буква Y перед номером штамма означает «the Yeasts» – дрожжи.

Кроме понятия «штамм» в микробиологии применяют термины «вариант», «тип», «форма». Они обычно используются для обозначения штаммов микроорганизмов, отличающихся по некоторым признакам от типового штамма. Штамм, отличающийся от типового по морфологическим особенностям, называют морфовар (морфотип), физиолого-биохимическим особенностям – биовар (биотип, физиологический тип), по способности синтезировать определенные химические соединения – хемовар (хемоформа, хемотип), условиям культивирования – культивар, по типу ответа на внедрение бактериофага – фаговар (фаготип, лизотип), антигенным характеристикам – серовар (серотип)
и т. п.

В работах по генетике микроорганизмов часто используют термин «клон», под которым подразумевают популяцию генетически родственных клеток, полученную неполовым путем из одной родительской клетки. В молекулярной биологии клоном называют множественные

копии идентичных последовательностей ДНК, полученные при их встраивании в клонирующие векторы (например, плазмиды). Под термином «генетически модифицированные», или «рекомбинантные», штаммы понимают штаммы микроорганизмов, полученные в результате генноинженерных манипуляций. Часто новые штаммы микроорганизмов получают с помощью мутагенов.

Каждый новый штамм микроорганизмов, выделенный из природных или техногенных источников, должен быть охарактеризован для получения полного набора данных о свойствах микроорганизма
в чистой культуре. Эти данные могут быть использованы, например, для составления паспорта ценных в промышленном отношении штаммов, а также для их идентификации.

Цель идентификации – установить таксономическое положение исследуемого штамма на основании сравнения его свойств с изученными и принятыми (официально зарегистрированными) видами. Поэтому результатом идентификации обычно является отождествление исследуемого микроорганизма с каким-нибудь видом или отнесение
к определенному роду. Если исследуемый штамм или группа штаммов отличаются по своим свойствам от представителей известных таксонов, то они могут быть выделены в новый таксон. Для этого дают описание нового таксона, включающее например, в случае бактерий, следующее: перечень штаммов, входящих в таксон; характеристику каждого штамма; перечень свойств, рассматриваемых в качестве существенных
в таксоне; перечень свойств, которые квалифицируют таксон для представительства в ближайшем более высоком таксоне; перечень диагностических характеристик, дифференцирующих предлагаемый таксон от близкородственных таксонов; отдельное описание типового (для вида) штамма; фотографию микроорганизма.

Чтобы вновь предлагаемый таксон мог быть официально принят, его описание должно быть опубликовано в соответствии с определенными правилами. Например, действительное или узаконенное опубликование таксона бактерий предусматривает помещение статьи с его описанием в Международном журнале по систематике и эволюционной микробиологии «International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology» (IJSEM). Если публикация появляется в другом авторитетном научном журнале (эффективное опубликование), то оттиск статьи из этого журнала направляется в IJSEM. С 1980 г. в IJSEM регулярно публикуются так называемые списки узаконенных наименований бактерий. В них перечисляются все наименования бактерий, которые были опубликованы в IJSEM (действительное или узаконенное опубликование) или эффективно опубликованы прежде в каких-либо

других авторитетных журналах. После внесения наименования бактерий в список узаконенных IJSEM наименований это наименование признается действительным, независимо от того, было ли оно ранее опубликовано в IJSEM или другом журнале. Дата появления публикации наименования данного таксона в IJSEM или в списке узаконенных наименований IJSEM является для таксона приоритетной.

Культура типового штамма нового вида микроорганизмов передается на хранение в одну из коллекций микроорганизмов мирового значения. В случае утери типового штамма возможна его замена на так называемый неотиповой штамм. При этом должно быть подтверждено, что свойства нового штамма хорошо совпадают с описанием утерянного. Чтобы показать, что таксон предлагается впервые, после названия нового семейства добавляется сокращенная комбинация «fam. nov.», нового рода – «gen. nov.», а нового вида – «sp. nov.». Например,
в 2000 г. с соавторами было предложено новое семейство бактерий – Oscillochloridaceae , fam. nov. Выражение «species insertac sedis» означает, что речь идет о виде, временно не имеющем определенного таксономического статуса, так как не ясно, в какой таксон более высокого порядка – род или семейство – следует поместить данный вид из-за недостатка необходимых для этого экспериментальных
данных.

2 ОПИСАНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ

МИКРООРГАНИЗМОВ

Как уже отмечалось, принципы классификации и идентификации разных групп прокариот и эукариотных микроорганизмов имеют существенные различия. Идентификация грибов до классов, порядков
и семейств основана на характерных чертах строения и способах образования, в первую очередь, половых структур. Кроме того, используется характеристика бесполых спороношений, строение и степень развития мицелия (зачаточный, хорошо развитый, септированный или несептированный), культуральные (колония) и физиологические признаки. Дифференциация родов внутри семейств и идентификация видов проводятся с применением морфологических признаков, полученных
с использованием электронной микроскопии, а также физиологических и культуральных особенностей. Единого определителя для идентификации всех грибов не существует, поэтому вначале определяют класс или порядок идентифицируемого гриба и далее пользуются соответствующим определителем для этого класса или порядка.

Идентификация дрожжевых грибов, которые относятся к числу широко используемых объектов разных микробиологических исследований, основана на культуральных (макроморфологических), цитологических , физиолого-биохимических особенностях, характеристике жизненных циклов и полового процесса, специфических признаках, связанных с экологией, и проводится с использованием специальных определителей для дрожжей.

В основе систематики микроскопических форм водорослей лежит строение их клеток и состав пигментов. Определение систематического положения простейших проводится с использованием морфологических особенностей и жизненных циклов. Таким образом, идентификация эукариот базируется главным образом на особенностях их морфологии и циклов развития.

Идентификация прокариот, которые морфологически менее разнообразны, чем эукариоты, основана на использовании широкого спектра фенотипических, а во многих случаях и генотипических признаков. Она в большей степени, чем идентификация эукариот, основывается на функциональных признаках, поскольку большинство бактерий можно идентифицировать не по их внешнему виду, а только выяснив, какие процессы они способны осуществлять.

При описании и идентификации бактерий изучают их культуральные свойства, морфологию, организацию клетки, физиолого-биохимические особенности, химический состав клеток, содержание

гуанина и цитозина (ГЦ) в ДНК, последовательность нуклеотидов в гене, кодирующем синтез 16S рРНК и другие фено - и генотипические признаки. При этом необходимо соблюдать следующие правила: работать с чистыми культурами, применять стандартные методы исследования, а также использовать для инокуляции клетки, находящиеся в активном физиологическом состоянии.

2.1 Культуральные свойства

К культуральным, или макроморфологическим, свойствам относятся характерные особенности роста микроорганизмов на плотных и жидких питательных средах.

2.1.1 Рост на плотных питательных средах

На поверхности плотных питательных сред в зависимости от посева микроорганизмы могут расти в виде колонии, штриха или сплошного газона. Колонией называют изолированное скопление клеток одного вида, выросшее в большинстве случаев из одной клетки. В зависимости от того, где развивались клетки (на поверхности плотной питательной среды, в толще ее или на дне сосуда), различают поверхностные, глубинные и донные колонии.

Образование поверх ностных колоний – наиболее существенная особенность роста многих микроорганизмов на плотном субстрате. Такие колонии отличаются большим разнообразием. При их описании учитывают следующие признаки:

профиль – плоский, выпуклый, кратерообразный, конусовидный и т. д. (рисунок 1);

форму – округлая, амебовидная, неправильная, ризоидная и т. д. (рисунок 2);

размер (диаметр) – измеряют в миллиметрах; если размеры колонии не превышают 1 мм, то их называют точечными;

поверхность – гладкая, шероховатая, бороздчатая, складчатая, морщинистая, с концентрическими кругами или радиально исчерченная;

блеск и прозрачность – колония блестящая, матовая, тусклая, мучнистая, прозрачная;

цвет – бесцветная (грязно-белые колонии относят к бесцветным) или пигментированная – белая, желтая, золотистая, оранже-
вая, сиреневая, красная, черная и т. д.; особо отмечают выделение в

субстрат пигмента; при описании колоний актиномицетов отмечают пигментацию воздушного и субстратного мицелия, а также выделение пигментов в среду;

край – ровный, волнистый, зубчатый, бахромчатый и т. д. (рисунок 3);

структуру – однородная, мелко - или крупнозернистая, струйчатая и т. д. (рисунок 4); край и структуру колонии определяют с помощью лупы или при малом увеличении микроскопа. Для этого чашку Петри помещают на столик микроскопа крышкой вниз;

консистенцию определяют, прикасаясь к поверхности колонии петлей. Колония может легко сниматься с агара, быть плотной, мягкой или врастающей в агар, слизистой (прилипает к петле), тягучей, иметь вид пленки (снимается целиком), быть хрупкой (легко ломается при прикосновении петлей).

1 – изогнутый; 2 – кратерообразный; 3 – бугристый;

4 – врастающий в субстрат; 5 – плоский; 6 – выпуклый;

7 – каплевидный; 8 – конусовидный

Рисунок 1 – Профиль колонии

Глубинные колонии, напротив, довольно однообразны. Чаще всего они по виду похожи на более или менее сплющенные чечевички,
в проекции имеющие форму овалов с заостренными концами. Лишь
у немногих бактерий глубинные колонии напоминают пучки ваты
с нитевидными выростами в питательную среду. Образование глубинных колоний часто сопровождается разрывом плотной среды, если микроорганизмы выделяют углекислоту или другие газы.

Донные колонии разных микроорганизмов обычно имеют вид тонких прозрачных пленок, стелющихся по дну.

Размеры и многие другие особенности колонии могут изменяться с возрастом и зависят от состава среды. Поэтому при их описании указывают возраст культуры, состав среды и температуру культивирования.

1 – круглая; 2 – круглая с фестончатым краем; 3 – круглая с валиком по краю; 4, 5 – ризоидные; 6 – с ризоидным краем; 7 – амебовидная;
8 – нитевидная; 9 – складчатая; 10 – неправильная;

11 – концентрическая; 12 – сложная

Рисунок 2 – Форма колонии

/ – гладкий; 2 – волнистый; 3 – зубчатый; 4 – лопастной; 5 – неправильный; 6 – реснитчатый; 7 – нитчатый; 8 – ворсинчатый; 9 – ветвистый

Рисунок 3 – Край колонии

1 – однородная; 2 – мелкозернистая; 3 – крупнозернистая;

4 – струйчатая; 5 – волокнистая

Рисунок 4 – Структура колонии

При описании роста микроорганизмов по штриху отмечают следующие особенности: скудный, умеренный или обильный, сплошной
с ровным или волнистым краем, четковидный, напоминающий цепочки изолированных колоний, диффузный, перистый, древовидный, или ризоидный (рисунок 5). Характеризуют оптические свойства налета, его цвет, поверхность и консистенцию.

Для описания колоний и роста по штриху многие микроорганизмы часто выращивают на мясопептонном агаре. Применяют также мясопептонную желатину. Для лучшего рассмотрения глубинных колоний среды с агаром или желатиной рекомендуется осветлять.

1 – сплошной с ровным краем; 2 – сплошной с волнистым краем; 3 – четковидный; 4 – диффузный; 5 – перистый; 6 – ризоидный

Рисунок 5 – Рост бактерий по штриху

2.1.2. Рост в жидких питательных средах

Рост микроорганизмов в жидких питательных средах более однообразен и сопровождается помутнением среды, образованием пленки или осадка. Характеризуя рост микроорганизмов в жидкой среде, отмечают степень помутнения (слабая, умеренная или сильная), особенности пленки (тонкая, плотная или рыхлая, гладкая или складчатая),
а при образовании осадка указывают скудный он или обильный, плотный, рыхлый, слизистый или хлопьевидный.

Нередко рост микроорганизмов сопровождается появлением запаха, пигментацией среды, выделением газа. Последнее обнаруживают по образованию пены, пузырьков, а также с помощью «поплавков» – маленьких, запаянных с одного конца трубочек. Поплавок помещают
в пробирку запаянным концом вверх перед стерилизацией среды и следят, чтобы он полностью был заполнен средой. В случае выделения газа он скапливается в поплавке в виде пузырька.

Для описания характера роста микроорганизмов в жидких средах их выращивают на мясопептонном бульоне (МПБ) или на другой среде, обеспечивающей хороший рост.

2.2 Морфологическая характеристика

Морфологическая характеристика и организация клеток бактерий включает такие признаки, как форма и размеры клеток, их подвижность, наличие жгутиков и тип жгутикования, способность к спорооб-разованию. Полезным может оказаться также выявление в клетках
характерных мембранных систем (хлоросом, карбоксисом, фикобилисом, газовых вакуолей и т. д.), присущих отдельным группам бакте-
рий, а также включений (параспоральных телец, гранул волютина,
поли-β-гидроксибутирата, полисахаридов и т. д.). Первостепенное значение для систематики бактерий придается окраске клеток по Граму
и строению их клеточных стенок.

2.3 Физиолого-биохимические свойства

Изучение физиолого-биохимических свойств включает, прежде всего, установление способа питания исследуемой бактерии (фото/хемо-, авто/гетеротрофия) и типа энергетического метаболизма (способность к брожению , аэробному или анаэробному дыханию или фотосинтезу). Важно определить такие признаки, как отношение бактерии к молекулярному кислороду, температуре, рН среды, солености, освещенности и другим факторам среды. В данную группу признаков

входит также перечень субстратов, утилизируемых в качестве источников углерода, азота и серы, потребность в витаминах и других факторах роста, образование характерных продуктов метаболизма, наличие некоторых ферментов. Для этого используют специальные тесты.

Многие тесты, применяемые для обнаружения перечисленных признаков (их иногда называют рутинными тестами), важны для диагностики и широко используются в медицинской микробиологии. Их постановка требует значительных затрат времени, большого количества сложных сред и реактивов, соблюдения стандартных условий проведения, аккуратности выполнения. Для ускорения и облегчения процесса идентификации некоторых микроорганизмов, имеющих главным образом медицинское значение, разработаны различные тест-системы, например, системы Oxi/Ferm Tube, Mycotube и Enterotube II фирмы Hoffmann-La Roche (Швейцария) и др. Так, система Enterotube II, предназначенная для идентификации энтеробактерий, представляет собой пластиковую камеру с 12 ячейками, содержащими окрашенные диагностические среды. Засев всех сред производится поступательно-вращатель-ными движениями через камеру иглы с посевным материалом. Инкубацию проводят в течение 24 ч при температуре 37 ºС. О положительном или отрицательном результате теста судят по изменению цвета среды, разрыву агара (тест на газообразование) или после введения специальных реактивов (тест на образование индола, реакция Фогес–Проскау-эра). Каждый признак обозначают определенной цифрой, поэтому полученные данные можно ввести в компьютер с соответствующей программой и получить ответ о таксономическом положении исследуемого штамма.

Определение состава клеток бактерий также имеет значение для их систематики (хемосистематика). Хемотаксономические методы могут быть важными, в частности, для тех групп бактерий, у которых морфологические и физиологические характеристики широко варьируются и недостаточны для проведения их удовлетворительной идентификации. В состав клеточных стенок разных прокариот входит несколько классов уникальных гетерополимеров: муреин (или псевдомуреин), липополисахариды, миколовые и тейхоевые кислоты. Состав клеточной стенки определяет и серологические свойства бактерий. Это лежит в основе иммунохимических методов их идентификации.

В качестве хемотаксономического маркера иногда используют также липидный и жирнокислотный состав клеток бактерий. Интенсивное изучение жирных кислот стало возможным с развитием метода газохроматографического анализа. Различия в составе липидов используют для идентификации бактерий на уровне рода и даже вида. Этот метод, однако, имеет определенные ограничения, поскольку содержание жирных кислот в клетках может зависеть от условий культивирования и возраста культуры.

В систематике некоторых бактерий учитывается состав хинонов
и других переносчиков электронов, а также пигментов.

Важная информация о взаимном родстве бактерий может быть получена при изучении клеточных белков – продуктов трансляции генов. На основании изучения мембранных, рибосомных, суммарных клеточных белков, а также отдельных ферментов сформировалось новое направление – белковая таксономия. Спектры рибосомных белков относятся к числу наиболее стабильных и используются для идентификации бактерий на уровне семейства или порядка. Спектры мембранных белков могут отражать родовые, видовые и даже внутривидовые различия. Однако характеристики химических соединений клетки не могут использоваться для идентификации бактерий изолированно от других данных, описывающих фенотип, поскольку нет критерия оценки значимости фенотипических признаков.

Иногда для идентификации бактерий или других микроорганизмов, например дрожжей, используют метод нумерической (или адансоновской) таксономии . В ее основе лежат идеи французского ботаника М. Адансона (M. Adanson), предложившего различные фенотипические признаки, поддающиеся учету, считать равноценными, что позволяет количественно выразить таксономические дистанции между организмами в виде отношения числа положительных признаков к общему числу изученных. Сходство между двумя исследуемыми организмами определяется путем количественной оценки возможно большего числа (обычно не менее ста) фенотипических признаков, которые подбираются так, чтобы их варианты были альтернативными и могли обозначаться знаками «минус» и «плюс». Степень сходства устанавливается на основании количества совпадающих признаков и выражается в виде коэффициента соответствия S :

где a + d – сумма признаков, по которым штаммы А и В совпадают;

а – оба штамма с положительными признаками;

d – оба с отрицательными;

b – сумма признаков, по которым штамм А положителен, В отрицателен;

с – сумма признаков, по которым штамм А отрицателен, штамм В положителен.

Значение коэффициента соответствия может меняться от 0 до 1. Коэффициент 1 означает полную идентичность, 0 – полное несходство. Оценки комбинаций признаков производятся с помощью компьютера. Полученные результаты представляют в виде матрицы сходства и/или в виде дендрограммы. Нумерическая таксономия может применяться при оценке сходства между таксонами микроорганизмов только невысокого ранга (роды, виды). Она не позволяет делать непосредственные выводы относительно генетического родства микроорганизмов, однако в известной степени отражает их филогенетические свойства. Так, установлено, что фенотипические признаки бактерий, поддающиеся изучению в настоящее время, отражают от 5 до 20 % свойств их генотипа.

2.4 Изучение генотипа

Изучение генотипа микроорганизмов стало возможным в результате успешного развития молекулярной биологии и привело к возникновению геносистематики. Исследование генотипа, основанное на анализе нуклеиновых кислот, в принципе дает возможность построить со временем естественную (филогенетическую) систему микроорганизмов. Филогенетические взаимоотношения бактерий оценивают определением молярного содержания гуанина и цитозина (ГЦ) в ДНК, методами ДНК –ДНК и ДНК –рРНК-гибридизации, с помощью ДНК-зондов, а также изучением последовательности нуклеотидов в 5 S , J 6 S и
23 S рРНК .

2.4.1 Определение молярного содержания ГЦ

Определение молярного содержания ГЦ от общего количества оснований ДНК у прокариот, как уже указывалось, колеблется от 25 до 75 %. Каждый вид бактерий имеет ДНК с характерным средним содержанием ГЦ. Однако поскольку генетический код вырожден, а генетическое кодирование основано не только на содержании нуклеотидных оснований в единицах кодирования (триплетах), но и на взаимном расположении, то одинаковое среднее содержание ГЦ в ДНК двух видов бактерий может сопровождаться их значительным генотипическим

разделением. Если два организма очень близки по нуклеотидному составу, то это может являться свидетельством их эволюционного родства только при условии, что они обладают большим числом общих фенотипических признаков или генетическим сходством, подтвержденным другими методами. В то же время расхождение (более 10…15 %) в нуклеотидном составе ДНК двух штаммов бактерий с общими фенотипическими свойствами показывает, что они относятся, по крайней мере, к разным видам.

2.4.2 Метод ДНК –ДНК-гибридизации

Данный метод является более важным для оценки генетического родства бактерий. При тщательном проведении экспериментов можно получить ценную информацию о степени их генетической гомологии. Внутри одного вида бактерий степень генетической гомологии штаммов достигает от 70 до 100 %. Однако если в результате эволюционной дивергенции последовательности нуклеотидных оснований геномов двух бактерий различаются в большей степени, то специфическая реассоциация ДНК–ДНК становится такой слабой, что не поддается измерению. В таком случае гибридизация ДНК–рРНК позволяет значительно увеличить круг организмов, у которых можно определить степень генетической гомологии благодаря тому, что на относительно небольшом участке бактериального генома, кодирующем рибосомные РНК, исходная последовательность оснований сохраняется значительно полнее, чем на других участках хромосомы. В итоге методом ДНК–рРНК-гибридизации часто обнаруживают довольно высокую гомологию геномов бактерий, у которых реассоциация ДНК–ДНК не выявляет заметной гомологии.

2.4.3 Метод ДНК-зондов (генных зондов)

Метод ДНК-зондов является разновидностью метода молекулярной гибридизации ДНК–ДНК. Реакция гибридизации ведется в этом случае не между двумя препаратами тотальной ДНК, а между фрагментом нуклеотидной последовательности ДНК (зондом), включающим ген (генетический маркер), ответственный за какую-то определенную функцию (например, устойчивость к какому-нибудь антибиотику), и ДНК изучаемой бактерии. Самым распространенным способом создания генных зондов является выделение специфических фрагментов путем молекулярного клонирования. Для этого вначале создают банк генов изучаемой бактерии расщеплением ее ДНК эндонуклеазами

рестрикции, а затем отбирают нужный клон из суммы фрагментов ДНК методом электрофореза с последующей проверкой генетических свойств этих фрагментов методом трансформации. Далее выбранный фрагмент ДНК лигируют в состав подходящей плазмиды (вектора),
а эту комбинированную плазмиду вводят в удобный для работы штамм бактерий (например, Escherichia coli ). Из биомассы бактерии, несущей ДНК-зонд, выделяют плазмидную ДНК и метят ее, например, радиоизотопной меткой. Затем осуществляют гибридизацию ДНК-зонда
с ДНК бактерии. Образовавшиеся гибридные участки проявляют методом авторадиографии. По относительной частоте гибридизации генетического маркера с хромосомой той или иной бактерии делают
заключение о генетическом родстве этих бактерий с исследуемым штаммом.

2.4.4 Метод анализа нуклеотидных последовательностей

в рибосомальных РНК

Для идентификации бактерий и создания филогенетической системы их классификации наиболее широкое распространение и значение получил метод анализа нуклеотидных последовательностей в рибосомальных РНК. Молекулы 5S, 16S и 23S рРНК содержат участки с самой высокой степенью генетической стабильности. Считают, что они находятся вне механизма действия естественного отбора и эволюционируют только в результате спонтанных мутаций, происходящих с постоянной скоростью. Накопление мутаций зависит только от времени, поэтому информация о нуклеотидной последовательности этих молекул считается наиболее объективной для определения филогенетического родства организмов на уровне от подвида до царства. В случае анализа
5S рРНК обычно определяют полную последовательность нуклеотидов, которая в этой молекуле у прокариот составляет 120 нуклеотидов. При исследовании 16S и 23S рРНК, содержащих 1500 и 2500 нуклеотидов соответственно, часто проводят анализ олигонуклеотидов, полученных из этих молекул с помощью специфических эндонуклеаз рестрикции. Наиболее широкое распространение получило изучение последовательности нуклеотидов в 16S рРНК. Изучение структуры 16S рРНК представителей разных микроорганизмов привело к выявлению среди прокариот группы архей. Значения коэффициента сходства SAB , отделяющие I6S рРНК бактерий и архей, лежат в пределах 0,1, в то время как значение SAB , равное 1,0, соответствует полной гомологии нуклеотидных последовательностей, а 0,02 – уровню случайного совпадения.

Все чаще для идентификации бактерий предлагают дендрограммы, показывающие взаимоотношения между бактериальными родами, видами или штаммами на основании изучения последовательности нуклеотидов (или олигонуклеотидов) в рРНК, а также ДНК–ДНК
и ДНК–рРНК гибридизации. Однако идентификация бактерий до родов на основании только генетических методов без предварительного изучения их фенотипических характеристик часто вообще невозможна. Поэтому лучшим подходом в работе по систематике бактерий считается изучение как генотипических, так и фенотипических свойств. В случае несоответствия между филогенетическими и фенотипическими данными приоритет временно отдают последним.

Особой проблемой является идентификация таких бактерий и архей, особенно морских видов, которые не способны расти на известных лабораторных питательных средах и для которых поэтому нельзя было получить чистую культуру. До недавнего времени эта проблема казалась неразрешимой. Однако около 15 лет назад были разработаны методы, позволившие экстрагировать, клонировать, секвенировать
и сравнивать рибосомные РНК прямо из окружающей среды. Это позволило точно сосчитать и идентифицировать микроорганизмы, населяющие данный биотоп без их выделения в чистую культуру. Идентифицированный таким образом «некультивируемый» в лаборатории микроорганизм может быть даже описан, но с присоединением слова «candidatus» (кандидат). Слово «candidatus» будет сопровождать новый вид до тех пор, пока учеными не будут найдены условия культивирования этого организма в лаборатории и не будет получена его чистая культура, что позволит изучить все его свойства и опубликовать в качестве узаконенного.

Идентификацию бактерий проводят обычно с помощью «Определителя бактерий Берджи» (Bergey"s Manual of Determinative Bacteriology). Первое издание этого пособия было осуществлено в 1923 г. под руководством известного американского бактериолога Д. Берджи (D. H.Bеrgey, 1860–1937). С тех пор оно регулярно переиздается с участием ведущих ученых-микробиологов мира. В последнем, девятом издании определи, все бактерии разделены на 35 групп по легко определяемым фенотипическим признакам. Эти признаки вынесены
в названии групп. Таксономическое положение бактерий внутри групп определяется с помощью таблиц и ключей, составленных на основе небольшого числа фенотипических признаков. Дифференцировочные таблицы для дифференциации видов бактерий некоторых родов, например рода Bacillus , не приводятся, а читатель отсылается к «Руководству Берджи по систематике бактерий».

В четырехтомном «Руководстве Берджи по систематике бактерий» (Bergey"s Manual of Systematic Bacteriology, 1984–1989) содержится более полная информация о таксономическом положении бактерий. Для каждой группы бактерий дается описание входящих в него родов
и видов, в том числе с неясным таксономическим статусом. Помимо подробного фенотипического описания, включающего морфологию, организацию и химический состав клеток, антигенные свойства, вид колоний, особенности жизненного цикла и экологии, в характеристике родов приводятся также сведения о содержании ГЦ в ДНК, результатах гибридизации ДНК–ДНК и ДНК–рРНК. Ключи и таблицы позволяют идентифицировать бактерии не только до рода, но и до вида.

В настоящее время вышло в свет второе издание четырехтомного «Руководства Берджи по систематике бактерий» (Bergcy"s Manual of Systematic Bacteriology). В 2002 г. вышел первый том. Кроме этого имеется ряд статей и книг, в которых предлагаются оригинальные ключи для идентификации отдельных групп бактерий, например, бацилл, псевдомонад, актиномицетов, энтеробактерий.

В настоящее время накопилось много новых данных, в том числе полученных в результате анализа нуклеотидных последовательностей рибосомальных РНК, об изученных ранее и вновь выделенных видах бактерий. На основании этих сведений видовой состав некоторых групп бактерий, например рода Bacillus , будет пересмотрен: часть видов останется в составе рода Bacillus , а некоторые образуют новые роды или будут отнесены к другим, уже существующим родам бактерий. Следует отметить также, что для описания новых штаммов бактерий изучают, как правило, больше признаков, чем необходимо для их идентификации, так как ключи и таблицы включают не все признаки идентифицируемых бактерий, а только те, которые отличаются у разных видов (таблица 1).

Таблица 1 – Минимальный перечень данных, необходимых для

описания новых штаммов бактерий (по H. Truper, K. Schleifer, 1992)

Продолжение таблицы 1

3 ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА «ИДЕНТИФИКАЦИЯ
МИКРООРГАНИЗМОВ»

Цель работы: знакомство с основными принципами определения микроорганизмов. В процессе выполнения лабораторной работы каждый студент изучает свойства бактерий, необходимые для описания бактериального штамма и идентификации его до уровня рода.

Задания

1. Определить чистоту идентифицируемой бактерии и изучить морфологию ее клеток.

2. Описать культуральные свойства.

3. Изучить цитологические свойства идентифицируемых бактерий.

4. Изучить физиолого-биохимические свойства идентифицируе-мых бактерий.

5. Определить чувствительность бактерий к антибиотикам.

6. Заполнить таблицу и подвести итоги.

3.1 Определение чистоты идентифицируемой бактерии

и изучение морфологии ее клеток

Для проведения работы по идентификации микроорганизмов каждый студент получает одну культуру бактерий (на скошенной агаризованной среде в пробирке), которую затем проверяет на чистоту. Это осуществляют несколькими способами: визуально, высевом на питательные среды и микроскопией.

Характер роста полученной бактерии просматривают по штриху на поверхности скошенной агаризованной среды. Если рост по штриху неоднороден, то культура загрязнена. Затем культуру отсевают в пробирку на скошенную среду (мясопептонный агар) для использования
в дальнейшей работе, а также делают рассев на поверхность твердой среды в чашке Петри методом истощающего штриха для проверки на чистоту (по однородности выросших колоний). Засеянные пробирки и чашки помещают в термостат при температуре 30 ºС на время от 2 до 3 суток. Остаток исходной культуры бактерии в пробирке используют для проверки на чистоту методом микроскопии (по морфологической однородности популяции), а также для изучения формы, взаимного расположения, подвижности клеток и их размеров. Микроскопируют культуру с использованием препаратов «раздавленная капля» и препарата фиксированных, окрашенных фуксином клеток. Результаты вносят в таблицу, составленную по форме таблицы 2.

Таблица 2 – Свойства идентифицируемой бактерии

3.2 Культуральные свойства

На следующем занятии просматривают чашку Петри, засеянную суспензией идентифицируемой бактерии. Критерием чистоты культуры является однородность выросших колоний. Описывают культуральные свойства бактериальных колоний в соответствии с разде-
лом 2.1 и результаты вносят в таблицу 2.

3.3 Изучение цитологических свойств идентифицируемых бактерий

3.3.1 Наличие эндоспор

Небольшое количество клеток с твердой среды помещают петлей на предметное стекло в каплю водопроводной воды и делают мазок. Мазок высушивают на воздухе, фиксируют в пламени горелки и наносят на него 5%-ный раствор хромовой кислоты. Через 5...10 мин ее смывают водой. Препарат накрывают полоской фильтровальной бумаги и обильно смачивают бумагу карболовым фуксином Циля. Подогревают препарат над пламенем до появления паров (не до кипения), затем отводят его в сторону и добавляют новую порцию красителя. Эту процедуру проводят в течение 7 мин. Важно, чтобы краситель испарялся, но бумага не подсыхала. После охлаждения ее снимают, препарат промывают водой и тщательно промокают фильтровальной бу-магой.

Если все операции проделаны правильно, окраска получается контрастной, и ярко-красные споры четко выделяются на голубом фоне цитоплазмы.

3.3.2 Окраска по Граму

3.3.2.1 На обезжиренном предметном стекле в капле воды делают тонкий мазок, чтобы клетки равномерно распределялись по поверхности стекла и не образовывали скоплений.

3.3.2.2 Препарат высушивают на воздухе, фиксируют над пламенем горелки и окрашивают в течение 1...2 мин карболовым генциановым или кристаллическим фиолетовым.

3.3.2.3 Затем краситель сливают и мазки обрабатывают 1…2 мин раствором Люголя до почернения.

3.3.2.4 Сливают раствор Люголя, препарат обесцвечивают в течение 0,5…1,0 мин 96%-ным этиловым спиртом и быстро промывают водой.

3.3.2.5 Дополнительно окрашивают в течение 1…2 мин водным фуксином.

3.3.2.6 Краситель сливают, препарат промывают водой и высушивают.

3.3.2.7 Микроскопируют с иммерсионной системой.

При правильном окрашивании грамположительные бактерии имеют сине-фиолетовый, грамотрицательные – розово-красный цвет.

Для получения достоверных результатов необходимо готовить мазки для окраски по Граму из молодых, активно растущих (обычно односуточных) культур, так как клетки из старых культур иногда дают неустойчивую реакцию по Граму. Грамотрицательные бактерии могут выглядеть как грамположительные, если бактериальная пленка (мазок) слишком толста и обесцвечивание спиртом не проведено до конца. Грамположительные бактерии могут выглядеть как грамотрицательные, если мазок переобесцвечен спиртом.

3.3.3 Окраска на кислотоустойчивость

На обезжиренном предметном стекле в капле воды готовят мазок исследуемой бактерии. Препарат высушивают на воздухе и фиксируют над пламенем горелки. На мазок помещают фильтровальную бамагу, заливают препарат карболовым фуксином Циля и 2–3 раза подогревают его до появления паров, держа предметное стекло с помощью пинцета высоко над пламенем горелки. За появлением паров наблюдают, глядя на мазок сбоку, и при их появлении тотчас отставляют
препарат в сторону. Дают препарату остыть, снимают фильтроваль-ную бумагу, сливают краситель и мазок промывают водой. Затем
клетки обесцвечивают 5%-ным раствором кислоты Нhttps://pandia.ru/text/79/131/images/image009_42.gif" width="11" height="23 src=">. Для этого предметное стекло погружают 2–3 раза в стакан с серной кислотой,

не задерживая его в ней. Препарат вновь тщательно промывают водой и докрашивают от 3 до 5 мин метиленовым синим (по Леффлеру). Краску сливают, препарат промывают водой, высушивают и рассматривают с иммерсионной системой. При правильном окрашивании клетки кислотоустойчивых бактерий имеют красный цвет, а некислотоустойчивых – синий.

3.3.4 Определение подвижности

Делают посев исследуемой культуры в столбик 0,2…0,5%-ного полужидкого агара методом укола. Для того чтобы особенности роста проявились наиболее четко, прокол делают в непосредственной близости от стенки пробирки. Посев ставят в термостат на 24 часа. Произведенный таким образом посев дает возможность выявить и отделить подвижные микроорганизмы от неподвижных.

Неподвижные формы бактерий растут по линии укола, образуя небольшие выросты цилиндрической или конической формы. Окружающая среда при этом остается совершенно прозрачной. Подвижные микробы при таком посеве вызывают выраженное помутнение, распространяющееся более или менее равномерно по всей толще среды.

3.4 Изучение физиолого-биохимических свойств

идентифицируемых бактерий

3.4.1 Отношение к молекулярному кислороду

По отношению к молекулярному кислороду микроорганизмы делят на четыре группы: облигатные аэробы, микроаэрофилы, факультативные аэробы (анаэробы) и облигатные анаэробы . Чтобы судить
о принадлежности микроорганизмов к той или иной группе, микробную суспензию высевают в пробирки с расплавленной и остуженной до температуры 45 ºС агаризованной питательной средой. Посев можно проводить и уколом. Строгие аэробы растут на поверхности среды и в верхнем слое, микроаэрофилы – на некотором расстоянии от поверхности. Факультативные анаэробы обычно развиваются по всей толще среды. Строгие анаэробы растут только в глубине среды, у самого дна пробирки (рисунок 6).

1 – аэробы; 2 – микроаэрофилы; 3 – факультативные анаэробы;

4 – анаэробы

Рисунок 6 – Рост микроорганизмов при посеве уколом (а ) и при посеве в расплавленную плотную среду (б )

3.4.2 Рост на среде с глюкозой и пептоном

Культуру вносят стерильной петлей в жидкую среду, содержащую: 5,0 г/л пептона, 1,0 г/л К2НР04, 10,0 г/л глюкозы, 2 мл бромтимолового синего (1,6%-ного спиртового раствора), дистиллированную воду, разлитую в пробирки (по 8…10 мл) с поплавками. Продолжительность культивирования 7 сут в термостате при температуре 30 °С. Рост микроорганизмов или его отсутствие определяют по помутнению среды, образованию пленки или осадка. Изменение цвета индикатора (бромтимолового синего) указывает на образование кислых (желтая окраска среды) или щелочных (синяя окраска среды) продуктов метаболизма. Об образовании газа свидетельствует накопление его в поплавке. Результаты наблюдений сравнивают со стерильной средой.

3.4.3 Рост на среде с желатиной

Активность у микроорганизмов внеклеточных протеолитических ферментов определяют, используя в качестве субстрата желатину, казеин или другие белки. Среда с желатиной состоит из мясопептонного бульона (МПБ) и 10…15 % желатины (МПЖ). Посев проводят уколом.

Бактериологической иглой стерильно отбирают клетки микроорганизмов с косяка и вводят иглу в толщу столбика МПЖ до дна пробирки.

Продолжительность культивирования от 7 до 10 суток при комнатной температуре. Разжижение желатины отмечают визуально. Если желатина разжижается, указывают интенсивность и форму разжижения – послойное, воронкообразное, мешковидное, кратеровидное, реповидное, пузыревидное.

3.4.4 Рост на среде с молоком

Высев на «молочный агар» в чашки Петри производят для определения способности бактерий разлагать казеин молока. Среда состоит из равных частей стерильного обезжиренного молока и стерильного 3%-ного водного агар-агара. Бактерии высевают петлей, проводя штрих по диаметру чашки или по центру сектора, на которые разделена чашка. Продолжительность культивирования бактерий в термостате при температуре 30 °С составляет 7 сут. Гидролиз казеина обнаруживают по зоне просветления среды вокруг колоний или выросшей по штриху культуры микроорганизмов. Особенно четко зона видна после обработки среды с выросшими бактериями раствором 5%-й трихлоруксусной кислоты. Зону гидролиза казеина измеряют в миллиметрах от края штриха или колонии до границы светлой зоны. Чем больше диаметр светлой зоны, тем выше казеинолитическая активность бак-терий.

3.4.5 Рост на среде с крахмалом

Высев на агаризованную среду с крахмалом (в чашки Петри), содержащую (г/л): пептон – 10,0; КН2Р04 – 5,0; растворимый крахмал – 2,0; агар – 15,0; рН 6,8 – 7,0, производят для определения образования микроорганизмами амилазы. Бактерии высевают петлей, проводя штрих по диаметру чашки или по центру сектора, на которые разделена чашка. Продолжительность культивирования бактерий 7 сут в термостате при температуре 30 °С. Гидролиз крахмала обнаруживают после обработки среды с выросшими бактериями раствором Люголя. Для этого на поверхность среды наливают от 3 до 5 мл раствора Люголя. Среда, содержащая крахмал, окрашивается в синий цвет, а зона гидролиза остается бесцветной или приобретает красно-бурую окраску, если крахмал гидролизовался до декстринов. Зону гидролиза крахмала измеряют от края штриха (колонии) до границы светлой зоны (мм). Чем больше диаметр светлой зоны, тем выше активность амилазы.

3.4.6 Тест на каталазу

Часть выросшей культуры суспензируют с помощью бактериологической петли в капле 3%-ной перекиси водорода на предметном стекле. О наличии каталазы свидетельствует образование пузырьков газа, наблюдаемое через 1…5 мин после внесения бактерий невооруженным глазом или под микроскопом при малом увеличении. Можно нанести несколько капель перекиси водорода непосредственно на колонию или на культуру, выросшую на скошенном агаре, и наблюдать выделение молекулярного кислорода.

3.4.7 Определение чувствительности бактерий
к антибиотикам

Чувствительность микроорганизмов к антибиотикам удобно определять с помощью готовых бумажных дисков, пропитанных определенными антибиотиками. Исследуемые микроорганизмы выращивают на соответствующей плотной питательной среде. Готовят в стерильной водопроводной воде густую суспензию изучаемого микроорганизма путем смыва клеток водой с поверхности твердой питательной среды. Работая около пламени горелки, вносят 1 мл полученной суспензии
в пробирку с 20 мл расплавленной и остуженной до температуры 50 ºС агаризованной среды, например, с мясопептонным агаром (МПА). Если микроорганизмы выращивали в жидкой питательной среде, то в агар вносят соответствующий объем культуры. Содержимое пробирки быстро и тщательно перемешивают и переливают в стерильную чашку Петри.

Когда среда застынет, на ее поверхность помещают бумаж-
ные диски на равном расстоянии друг от друга и на расстоянии

1,5…2,0 см от края чашки. Чашки Петри выдерживают 2 часа при комнатной температуре для лучшей диффузии антибиотиков в толщу агаризованной среды, а затем, не переворачивая, помещают в термостат на 24 ч при температуре 30 ºС. Через сутки отмечают образование зон подавления роста исследуемых микроорганизмов вокруг дисков. Если исследуемая бактерия чувствительна к определенным антибиотикам, то вокруг дисков обнаруживаются зоны отсутствия роста культуры. Диаметр зоны подавления роста измеряют миллиметровой линейкой и записывают результаты в таблицу 3. Зона более 30 мм свидетельствует
о высокой чувствительности микроорганизмов к антибиотику, а менее 12 мм – о слабой чувствительности.

Когда в распоряжении экспериментатора имеются растворы
антибиотических веществ или культуральные жидкости, содержащие

антибиотик, используют метод с применением лунок в толще агара.
В этом случае в застывшей агаризованной среде, засеянной испытуемым микроорганизмом, стерильным пробочным сверлом (диаметр от 6 до 8 мм) делают лунки на расстоянии 1,5…2,0 см от края чашки.
В лунки вносят растворы антибиотиков или культуральную жидкость. Этот метод позволяет также выявить способность к образованию антибиотических веществ микроорганизмами, выращенными в жидкой среде.

Таблица 3 – Действие антибиотиков на рост бактерий

4 КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1. Дайте определения следующих терминов:

– штамм; аутентичный штамм; типовой штамм;

– колония;

– культуральные свойства;

– таксономия;

– классификация;

– номенклатура;

– плазмида;

– фаготипирование.

2. Какие разделы включает систематика микроорганизмов? Дайте их характеристику.

3. Почему существующие системы классификации микроорганиз - мов носят искусственный характер?

5. По каким признакам различаются разные штаммы одного вида микроорганизма?

6. Какие таксономические категории микроорганизмов относят к обязательным, а какие к необязательным?

7. Перечислите основные правила номенклатуры микроорганиз - мов.

8. В чем состоит основная цель идентификации микроорганизмов?

9. Чем различаются принципы классификации и идентификации разных групп прокариот и эукариот?

10. Какие свойства изучают при описании и идентификации бактерий?

11. Какие признаки учитывают при описании поверхностных, глубинных и донных колоний микроорганизмов?

12. Какие особенности отмечают при описании роста микроорга - низмов по штриху?

13. Что отмечают, характеризуя рост микроорганизмов в жидкой питательной среде?

14. Какие признаки включает морфологическая характеристика и организация клеток бактерий?

15. Какие физиолого-биохимические свойства изучают при идентификации бактерий?

16. В каких случаях необходимо использовать хемотаксономи - ческие методы?

17. Приведите примеры веществ, используемых в качестве хемо - таксономических маркеров?

18. В чем особенности белковой таксономии?

19. Охарактеризуйте метод нумерической таксономии, какие ограничения он имеет?

20. Какими методами оценивают филогенетические взаимоотно - шения бактерий?

21. В чем суть метода ДНК-зондов и его отличие от метода
ДНК–ДНК-гибридизации?

22. Каковы особенности метода анализа нуклеотидных последо - вательностей в рибосомальных РНК?

23. Какие признаки положены в основу классификации бактерий в «Определителе бактерий Берджи»?

24. Какие свойства и признаки изучают при описании новых штаммов бактерий?

25. Какими способами определяют чистоту идентифицируемой бактерии?

26. Каковы основные правила выполнения методики окраски по Граму?

27. На какие группы делят микроорганизмы по отношению к молекулярному кислороду?

28. Что используют в качестве субстрата при определении активности внеклеточных протолитических ферментов у микроорганизмов?

29. Какие методы определения чувствительности микроорганиз - мов к антибиотикам вы знаете, дайте их характеристику.

30. Каким методом определяют образование микроорганизмами амилазы?

31. Каким образом произведенный посев дает возможность выявить и отделить подвижные микроорганизмы от неподвижных?

5 РЕЦЕПТЫ КРАСИТЕЛЕЙ И ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД

5.1 Фуксин основной карболовый (фуксин Циля)

– 5%-ный водный раствор свежеперегнанного фенола – 100 мл;

– насыщенный спиртовой раствор фуксина основного – 10 мл;

Приготовленную смесь через 48 ч отфильтровывают.

5.2 Метиленовый синий (по Леффлеру)

– насыщенный спиртовой раствор метиленового синего – 30 мл;

– вода дистиллированная – 100 мл;

– 1%-ный водный раствор КОН – 1 мл.

5.3 Мясопептонный бульон (МПБ)

500 г мясного фарша без жира и сухожилий заливают 1 л водопроводной воды и экстрагируют при комнатной температуре 12 ч или в термостате при температуре 37 ºС – 2ч, а при температуре 50 ºС – один час. Затем мясо отжимают через марлю, и полученный настой кипятят 30 мин. При этом свертываются белки. Остывшую массу фильтруют через ватный фильтр и доливают водой до первоначального объема. Далее к 1 л мясного бульона добавляют от 5 до 10 г пептона и 5 г поваренной соли. Среду нагревают до растворения пептона, постоянно помешивая. МПБ стерилизуют при давлении 2 атм 20 минут.

5.4 Мясопептонный агар (МПА)

К 1 л МПБ добавляют 20 г агара. Среду нагревают до раство-рения агара, затем устанавливают слабощелочную реакцию среды

20%-ным раствором NaCO64" height="52" bgcolor="white" style="vertical-align:top;background: white">

Бактерии могут все и еще чуть-чуть. Они создали наш мир – пригодный для дыхания воздух, плодородную почву, полезные ископаемые. Даже возникновение жизни на Земле – результат такого свойства бактерий, как изменчивость, способность тщательно отбирать и передавать по наследству генетическую информацию, направленную на сохранение и развитие вида.

Свойство – это отличительная черта, характерный признак предмета или объекта. Микробиология изучает свойства микроорганизмов – их строение, закономерности развития, роль в сохранении природного баланса и хозяйственной деятельности человека.

При изучении одноклеточных первый этап идентификации опирается на общие свойства бактерий, присущие всем прокариотам (безъядерным клеткам):

• микроскопические размеры (не видны невооруженным взглядом);
• огромная скорость обмена веществ и, как следствие, роста и размножения;
• быстрая адаптация к изменившимся условиям существования;
• способность меняться в короткие сроки с передачей наследственности;

Еще одна черта, общая для всех одноклеточных, – широкое распространение. Микроорганизмы существуют везде – в воде, воздухе, земле, организме человека и животных. Граничные условия их обитания простираются от температур в сотни градусов и давления воды на глубине в несколько километров до разреженного воздуха и отрицательных температур стратосферы. Правда, любопытные исследователи нашли место на земле, где не так-то просто найти бактерии, – отдельные участки пустыни Атакама (Южная Америка). Эта земля не видела дождя десятки, а возможно, и сотни лет. Даже бактерии сдались – вода необходима любой форме белковой жизни.

Идентификация бактерий по видам

Ученые разделяют бактерии по видам, вернее, пытаются это сделать. Предположительно (ну не известно науке точно!) существуют миллионы видов бактериальных клеток. Но «узнать в лицо» наука может только несколько десятков тысяч, характеристики которых хорошо изучены. Например, бифидобактерии и лактобактерии необходимы для пищеварения, свойства молочнокислых бактерий и дрожжевых грибков используются в промышленности, патогенные микроорганизмы несут болезни или вызывают пищевые отравления, образуя опасные токсины и т. д.

Для видовой идентификации бактерий нужно знать следующие их свойства:

• морфологические (форма, строение клетки);
• культуральные (способ питания, условия размножения, т. е факторы роста бактериальной культуры);
• тинкториальные (реакция на красители, помогающая определить степень опасности для здоровья);
• биохимические (расщепление питательных веществ, выделение продуктов жизнедеятельности, синтез ферментов, белков, витаминов);
• антигенные (от англ. antibody-generator – «производитель антител»), вызывающие иммунную реакцию организма.

Морфологические свойства определяют с помощью микроскопии (рассматривая в обычный или электронный микроскоп). Культуральные (биологические) свойства проявляются во время роста культур на питательных средах. Идентификация по биохимическим свойствам нужна для определения отношения клетки к кислороду (способ дыхания), ее ферментативных и редуцирующих (восстановительных) свойств (редукция – химический процесс отнятия кислорода или замена его на водород). Кроме того, биохимические исследования изучают образование отходов жизнедеятельности бактерий (токсинов) и их влияние на окружающую среду.

Анализ всех этих свойств в совокупности помогает определить вид бактериальной клетки. Такая идентификация дает возможность отличать «хорошие» бактерии, приносящие пользу, от вредных болезнетворных микробов с отрицательными свойствами. Строго говоря, это разделение достаточно условно. Один и тот же вид бактерий может оказывать положительное или отрицательное действие в зависимости от ситуации. Например, кишечная палочка является частью микрофлоры здорового человека и принимает активное участие в пищеварении. Но стоит популяции этих бактерий разрастись выше граничных параметров – возникает опасность отравления токсинами, опасными для здоровья.

Как выглядят бактерии

Внешний вид и параметры клетки влияют на ее свойства – подвижность, функциональные особенности, крепление к поверхности. По форме микроорганизмы разделяются на:

1. Кокки – шаровидные или округлые бактерии. Они различаются по количеству клеток в сцепке:

• микрококки (единичная клетка);
• диплококки (две клетки, соединенные между собой);
• тетракокки (четыре соединенные клетки);
• стрептококки (соединенные в длину в виде цепи);
• сарцины (пласты или пакеты из 8, 12, 16 и более штук);
• стафилококки (соединение имеет форму виноградной грозди).

2. Палочки различают:

• по форме концов: плоские (обрубленные), округлые (полусфера), острые (конус), утолщенные;
• по характеру соединения: одиночные, пары, цепочки (стрептобактерии).

3. Спирали имеют изогнутую или спиральную форму (строго говоря, эти бактерии тоже относят к палочковидным). Они выделяются формой и количеством завитков:

• вибрионы – немного выгнутые;
• спириллы – один или несколько витков (до четырех);
• свыше четырех завитков имеют борелли (от 4 до 12) и (любимое ругательство доктора Быкова, возбудители сифилиса) трепонемы (от 14 до 17 мелких витков);
• лептоспиры похожи на латинскую «S».

Кроме этого, существуют звездочки, кубики, С-образные и другие формы клеток. Более того, один и тот же вид бактерий в зависимости от обстоятельств может менять форму, причем значительно. Например, молочнокислые бактерии представляют собой палочки, но одни представители вида могут иметь форму очень короткой палочки (почти шара), тогда как другие вытягиваются в длину, приближаясь к нитевидным клеткам. Длина в данном случае зависит от состава среды, наличия и процентного содержания кислорода, способа культивирования (искусственного выращивания) микроорганизмов.

С размерами одноклеточных немного проще:

• самые маленькие (бруцеллы);
• средние (бактероид, кишечная палочка);
• большие (бациллы, клостридии).

Строение микроорганизмов

Общим для всех прокариот является отсутствие ядра, его роль выполняет замкнутая молекула ДНК (нуклеоид). Роль внутренних органов в бактериальной клетке выполняют различные включения, именуемые по аналогии органеллами. У разных видов бактерий этот набор не одинаков, но есть некий обязательный минимум, присутствующий у каждой бактерии:

• нуклеоид (аналог ядра);
• клеточная стенка (наружный слой различной толщины);
• цитоплазматическая мембрана (тонкая пленка между внутренней полужидкой средой и клеточной стенкой);
• цитоплазма (внутренняя полужидкая субстанция, в которой плавают органеллы);
• рибосомы (молекулы РНК, содержащие дополнительную или резервную генетическую информацию).

Первые попытки рассмотреть строение бактерии в микроскоп выявили одну важную деталь – бактериальные клетки прозрачны, увидеть их без дополнительной подготовки невозможно. Датский исследователь Грам предложил метод, позволяющий окрашивать микроорганизмы с помощью анилиновых красителей. Оказалось, что в зависимости от строения наружной оболочки бактерии воспринимают краситель по-разному – одни задерживают пигмент, другие обесцвечиваются после окончательной промывки подготовленного препарата спиртосодержащим раствором (промывка производится в обоих случаях, но только в одном вымывает краску). По толщине клеточных стенок бактерии разделяют на две большие группы:

• грамположительные (толстая стенка поддается окраске);
• грамотрицательные (тонкая стенка не удерживает краситель).

Эти свойства важны для идентификации – чаще всего грамотрицательными бывают вредные (патогенные) микроорганизмы. Подобное разделение особенно удобно для медицинских исследований. Можно получить быстрый результат при относительно простом лабораторном анализе.

Помимо основных, у микроорганизмов существуют дополнительные структуры, определяющие некоторые важные свойства клетки:

1. Капсула – поверхностный (над клеточной оболочкой) слизистый слой, образующийся как реакция на окружающую среду. Т. е. в комфортных условиях бактерия вполне может обойтись без капсулы, но при малейшей угрозе защищает себя мягкой оболочкой, дающей дополнительную безопасность.
2. Жгутики – длинные (длиннее тела бактерии) нитевидные органы перемещения. Они работают как своеобразный двигатель, позволяя клетке свободно перемещаться.
3. Пили – очень мелкие ворсинки на поверхности бактерии (тоньше и короче жгутиков). Пили не перемещают клетку, но помогают ей надежно закрепиться в выбранном месте.
4. Споры – твердые включения, образующиеся внутри бактерий как реакция на угрозу гибели (отсутствие воды, агрессивная среда). Они позволяют клетке пережить тяжелые времена (иногда бактерия может «спать» годами и десятилетиями) и снова возродиться. Но споры – это только инструмент выживания, а не размножения.

Есть еще дополнительные включения, придающие бактерии различные свойства. Так, хлоросомы отвечают за выработку кислорода из энергии солнечного света (фотосинтез); газовые вакуоли придают клетке плавучесть; липиды и волютин сохраняют запасы пищи и энергии и т. д.

Рост и размножение

Для точной идентификации и промышленного производства необходимы чистые культуры бактерий – популяция, выращенная из единичной клетки в лабораторных условиях. А для этого нужно знать их биологические свойства – в каких условиях и каким образом растут и размножаются микроорганизмы. Рост – это увеличение клеточной массы и всех ее структур, а размножение – увеличение количества клеток в колонии.

Большинство бактерий размножаются методом бинарного деления, т. е. клетка делится надвое посередине, образуя два идентичных организма. Метод почкования отличается от бинарного деления только формой – на поверхности клетки образуется выступ, куда перемещается половинка разделившегося заменителя ядра (нуклеоида), затем выступ разрастается и отделяется от материнской клетки.

Более сложный метод – генетическая рекомбинация, напоминающая половое размножение. Суть метода в том, что часть ДНК попадает в клетку извне (при контакте бактерий между собой, с помощью бактериофагов или в результате поглощения генетического материала погибших клеток). В результате такой метод дает две генетически измененных клетки, несущих информацию от обоих «родителей». Свойства измененной клетки могут значительно отличаться от ее предшественниц. Такой метод размножения позволяет бактериям приспосабливаться к изменившимся условиям, возможно, именно он послужил основой возникновения разумной жизни на планете.

Кроме того, рекомбинантный метод размножения облегчает генетические исследования. Бактерии меняются в очень короткие сроки и при этом сохраняют наследственность. Это дает возможность проследить за несколькими поколениями клетки и оценить положительные и отрицательные изменения в ее структуре, поведении, свойствах.

Особенности дыхания и питания клетки

В зависимости от отношения к кислороду бактерии различаются на:

1. Анаэробы – микроорганизмы, получающие энергию при отсутствии кислорода. Различают облигатные (строгие) анаэробы, не переносящие кислорода, и факультативные анаэробы (большинство патогенных микробов), основным методом получения энергии которых является бескислородный вариант, но они могут существовать и при доступе кислорода.
2. Аэробы – клетки, живущие только в кислородосодержащей среде. Строгие аэробы требуют 20% кислорода в атмосфере, микроаэрофилы довольствуются гораздо меньшим содержанием кислорода, но основной метод дыхания у них остается таким же, как и у аэробных клеток.

Идентификация по способу дыхания и питания важна для создания комфортных условий при выращивании бактериальных культур на искусственных средах и в биотехнологиях.

Благодаря разнонаправленным полезным свойствам бактерий получается замкнутый цикл – автотрофы создают органические вещества, используя энергию солнца или неорганические соединения, гетеротрофы (сапрофиты) разлагают органику, возвращая в природу химические компоненты, пригодные для дальнейшего использования.

Ферменты и токсины бактерий (биохимическая активность)

Микроорганизмы вырабатывают белковые вещества – ферменты (лат. «закваска») или энзимы (греч. «закваска»), которые служат катализаторами (ускорителями) в абсолютно всех биологических процессах (обмен веществ и энергии). Причем каждый отдельно взятый фермент отвечает только за один процесс превращения одного соединения в другое. Ферменты делят на:

• эндоферменты – внутриклеточные вещества, принимают участие в метаболизме клетки.
• экзоферменты – внеклеточные (выделяемые в окружающую среду), они осуществляют переваривание снаружи бактериальной клетки.

Свойства микроорганизмов выделять определенные ферменты используют для идентификации вида одноклеточных, так как это постоянный и неизменный признак, присущий только данной разновидности клеток. Различают:

1. Сахаролитические свойства клетки – способность ферментировать (разлагать) углеводы с выделением химической энергии. Например, при спиртовом брожении ферменты дрожжей разлагают сахар на этиловый спирт и углекислый газ.
2. Протеолитические свойства микроорганизмов – ферментация белков и пептона (крупные белковые фрагменты, образующиеся на начальной стадии переваривания молока и мяса под действием ферментов). Клетки выделяют во внешнюю среду протеолитические ферменты, которые расщепляют белки до промежуточных продуктов (пептоны, аминокислоты) и/или до конечных продуктов распада (сероводород, аммиак). От протеолитических ферментов зависит усвоение белков, свертывание крови.

Биохимическая идентификация дает возможность различать практически идентичные виды бактерий, строение и внешний вид которых неотличимы друг от друга. Например, патогенные энтеробактерии насчитывают сотни видов, определить конкретного виновника заболевания можно только с помощью изучения биохимических свойств.

Вредные отходы жизнедеятельности клетки (токсины) крайне опасны, тем не менее важны. При попадании токсинов в организм происходит выработка антител, которые идентифицируют и нейтрализуют чужеродные объекты. Бактериальные токсины вызывают нарушения обменных и других процессов в клетке, этим объясняется их высокая активность даже при небольшом количестве токсина в организме. Различают:

• экзотоксины (выделяются в окружающую среду, очень опасны);
• эндотоксины (структурные компоненты клетки, попадают в окружающую среду только после гибели бактерии, менее опасны, чем экзотоксины).

Любые токсины опасны, но экзотоксины причиняют больший вред. Однако способность этих токсинов вызывать образование антител (антигенов) дает возможность производить лечебные и профилактические сыворотки против многих болезней.

Некоторые бактерии обладают гемолитическими свойствами, т. е. выделяют токсины, разрушающие эритроциты (гемолизины). В естественном процессе обновления эритроцитов гемолитические свойства клеток необходимы, но они могут стать опасными при патологическом развитии процесса.

Бактерии вездесущи и многообразны. Есть «добрые», полезные микроорганизмы, но есть и вредные, патогенные микробы, провоцирующие болезни и выделяющие опасные токсины. Человек научился использовать полезные свойства микроорганизмов в биотехнологиях для улучшения качества жизни. Медицина активно (и иногда эффективно) борется с возбудителями болезней. В силах любого человека защитить себя от вредных бактерий (обычные правила гигиены) и взять все лучшее от многообразия бактериального мира.

Антигены – это высокомолекулярные соединения. При попадании в организм вызывают иммунную реакцию и взаимодействуют с продуктами этой реакции: антителами и активированными лимфоцитами.

Классификация антигенов.

1. По происхождению:

1) естественные (белки, углеводы, нуклеиновые кислоты, бактериальные экзо– и эндотоксины, антигены клеток тканей и крови);

2) искусственные (динитрофенилированные белки и углеводы);

3) синтетические (синтезированные полиаминокислоты, полипептиды).

2. По химической природе:

1) белки (гормоны, ферменты и др.);

2) углеводы (декстран);

3) нуклеиновые кислоты (ДНК, РНК);

4) конъюгированные антигены (динитрофенилированные белки);

5) полипептиды (полимеры a-аминокислот, кополимеры глутамина и аланина);

6) липиды (холестерин, лецитин, которые могут выступать в роли гаптена, но, соединившись с белками сыворотки крови, они приобретают антигенные свойства).

3. По генетическому отношению:

1) аутоантигены (происходят из тканей собственного организма);

2) изоантигены (происходят от генетически идентичного донора);

3) аллоантигены (происходят от неродственного донора того же вида);

4) ксеноантигены (происходят от донора другого вида).

4. По характеру иммунного ответа:

1) тимусзависимые антигены (иммунный ответ зависит от активного участия Т-лимфоцитов);

2) тимуснезависимые антигены (запускают иммунный ответ и синтез антител В-клетками без Т-лимфоцитов).

Выделяют также:

1) внешние антигены; попадают в организм извне. Это микроорганизмы, трансплантированные клетки и чужеродные частицы, которые могут попадать в организм алиментарным, ингаляционным или парентеральным путем;

2) внутренние антигены; возникают из поврежденных молекул организма, которые распознаются как чужие;

3) скрытые антигены – определенные антигены (например, нервная ткань, белки хрусталика и сперматозоиды); анатомически отделены от иммунной системы гистогематическими барьерами в процессе эмбриогенеза; толерантность к этим молекулам не возникает; их попадание в кровоток может приводить к иммунному ответу.

Иммунологическая реактивность против измененных или скрытых собственных антигенов возникает при некоторых аутоиммунных заболеваниях.

Свойства антигенов:

1) антигенность – способность вызывать образование антител;

2) иммуногенность – способность создавать иммунитет;

3) специфичность – антигенные особенности, благодаря наличию которых антигены отличаются друг от друга.

Гаптены – низкомолекулярные вещества, которые в обычных условиях не вызывают иммунной реакции, но при связывании с высокомолекулярными молекулами приобретают иммуногенность. К гаптенам относятся лекарственные препараты и большинство химических веществ. Они способны вызывать иммунный ответ после связывания с белками организма.

Антигены или гаптены, которые при повторном попадании в организм вызывают аллергическую реакцию, называются аллергенами.

Инфекционные антигены – это антигены бактерий, вирусов, грибов, простейших.

Существуют следующие разновидности бактериальных антигенов:

1) группоспецифические (встречаются у разных видов одного рода или семейства);

2) видоспецифические (встречаются у различных представителей одного вида);

3) типоспецифические (определяют серологические варианты – серовары, антигеновары – внутри одного вида).

В зависимости от локализации в бактериальной клетке различают:

1) О – АГ – полисахарид; входит в состав клеточной стенки бактерий. Определяет антигенную специфичность липополисахарида клеточной стенки; по нему различают сероварианты бактерий одного вида. О – АГ слабо иммуногенен. Он термостабилен (выдерживает кипячение в течение 1–2 ч), химически устойчив (выдерживает обработку формалином и этанолом);

2) липид А – гетеродимер; содержит глюкозамин и жирные кислоты. Он обладает сильной адьювантной, неспецифической иммуностимулирующей активностью и токсичностью;

3) Н – АГ; входит в состав бактериальных жгутиков, основа его – белок флагеллин. Термолабилен;

4) К – АГ – гетерогенная группа поверхностных, капсульных антигенов бактерий. Они находятся в капсуле и связаны с поверхностным слоем липополисахарида клеточной стенки;

5) токсины, нуклеопротеины, рибосомы и ферменты бактерий.

Антигены вирусов:

1) суперкапсидные антигены – поверхностные оболочечные;

2) белковые и гликопротеидные антигены;

3) капсидные – оболочечные;

4) нуклеопротеидные (сердцевинные) антигены.

Все вирусные антигены Т-зависимые.

Протективные антигены – это совокупность антигенных детерминант (эпитопов), которые вызывают наиболее сильный иммунный ответ, что предохраняет организм от повторного инфицирования данным возбудителем.

Пути проникновения инфекционных антигенов в организм:

1) через поврежденную и иногда неповрежденную кожу;

2) через слизистые оболочки носа, рта, ЖКТ, мочеполовых путей.

Гетероантигены – общие для представителей разных видов антигенные комплексы или общие антигенные детерминанты на различающихся по другим свойствам комплексах. За счет гетероантигенов могут возникать перекрестные иммунологические реакции.

У микробов различных видов и у человека встречаются общие, сходные по строению антигены. Эти явления называются антигенной мимикрией.

Суперантигены – это особая группа антигенов, которые в очень малых дозах вызывают поликлональную активацию и пролиферацию большого числа Т-лимфоцитов. Суперантигенами являются бактериальные энтеротоксины, стафилококковые, холерные токсины, некоторые вирусы (ротавирусы).

Биохимические свойства в основном типичны для рода Salmonella. Отличительными особенностями являются: отсутствие газообразования при ферментации S. Typhi, неспособность S. Paratyphi A продуцировать сероводород и декарбоксилировать лизин.

Эпидемиология. Брюшной тиф и паратифы являются антропонозами, т.е. вызывают заболевание только у человека. Источником инфекции являются больной или бактерионоситель, которые выделяют возбудитель во внешнюю среду с испражнениями, мочой, слюной. Возбудители этих инфекций, как и другие сальмонеллы, устойчивы во внешней среде, сохраняются в почве, воде. S. Typhi может переходить в некультивируемую форму. Благоприятной для их размножения средой являются пищевые продукты (молоко, сметана, творог, мясной фарш, студень). Передача возбудителя осуществляется водным путем, играющим в настоящее время существенную роль, а также алиментарным и контактно-бытовым путями. Заражающая доза равна приблизительно 1000 клеткам. Естественная восприимчивость людей к этим инфекциям высокая.

Патогенез и клиническая картина. Попав в тонкую кишку, возбудители тифа и паратифов инвазируют слизистую оболочку при

помощи эффекторных белков ТТСС-1, формируя первичный очаг инфекции в пейеровых бляшках. Следует отметить, что в под- слизистой оболочке осмотическое давление по сравнению с просветом кишечника ниже. Это способствует интенсивному синтезу Vi-антигена, который увеличивает антифагоцитарную активность возбудителя и подавляет выброс провоспалительных тканевых медиаторов клетками подслизистой оболочки. Следствием этого яв- ляются отсутствие развития воспалительной диареи на начальных этапах инфекции и интенсивное размножение микробов в макрофагах, приводящее к воспалению пейеровых бляшек и развитию лимфаденита, следствием чего являются нарушение барьерной функции мезентериальных лимфатических узлов и проникновение сальмонелл в кровь, в результате чего развивается бактериемия. Это совпадает с концом инкубационного периода, который длится 10-14 сут. Во время бактериемии, которая сопровождает весь лихорадочный период, возбудители тифа и паратифов с током крови разносятся по организму, оседая в ретикулоэндотели- альных элементах паренхиматозных органов: печени, селезенки, легких, а также в костном мозгу, где они размножаются в макрофагах. Из купферовских клеток печени сальмонеллы по желчным протокам, в которые они диффундируют, попадают в желчный пузырь, где они также размножаются. Накапливаясь в желчном пузыре, сальмонеллы вызывают его воспаление и с током желчи реинфицируют тонкую кишку. Повторное внедрение сальмонелл в пейеровы бляшки приводит к развитию в них гиперергического воспаления по типу феномена Артюса, их некрозу и изъязвлению, что может привести к кишечному кровотечению и прободению кишечной стенки. Способность возбудителей брюшного тифа и паратифов сохраняться и размножаться в фагоцитирующих клетках при функциональной недостаточности последних приводит к формированию бактерионосительства. Сальмонеллы также могут длительное время сохраняться в желчном пузыре, выделяясь с фекалиями в течение длительного времени, и контаминировать окружающую среду. К концу 2-й нед заболевания возбудитель начинает выделяться из организма с мочой, потом, материнским молоком. Диарея начинается в конце 2-й или начале 3-й нед заболевания, с этого время возбудители высеваются из фекалий.

Идентификация микробов – это определение систематического положения выделенной из какого-либо источника культуры до уровня вида или варианта. В случае уверенности в чистоте выделенной в процессе культурального метода культуры приступают к ее идентификации, опираясь при этом на ключи (то есть известный перечень ферментативной активности, известную антигенную структуру), классификацию и характеристику типовых штаммов, описанных в руководствах.

В целях идентификации используют комплекс признаков: морфологических (форма, размеры, структура, наличие жгутиков, капсулы, спор, взаимное расположение в мазке), тинкториальных (окраска по Граму и иными методами), химических (Г+Ц в ДНК и содержание, напр., пептидогликана, целлюлозы, хитина и др.), культуральных (питательные потребности, условия, темпы и характер роста на разных средах), биохимических (ферментативная деградация и трансформация различных веществ с образованием промежуточных и конечных продуктов), серологических (антигенная структура, специфичность, связи), экологических (вирулентность, токсигенность, токсичность, аллергенность микробов и их продуктов, круг восприимчивых животных и др. биосистем, тропизм, межвидовые и внутривидовые взаимоотношения, влияние факторов внешней среды, включая фаги, бактериоцины, антибиотики, антисептики, дезинфектанты).

При идентификации микроорганизмов нет необходимости изучать все свойства. Более того, с экономической точки зрения важно, чтобы круг испытанных тестов был не большим, чем это необходимо ; желательно также использовать простые (но надежные) тесты, доступные широкому кругу лабораторий.

Идентификацию микроорганизмов начинают с отнесения культуры к крупным таксонам (тип, класс, порядок, сем.). Для этого часто достаточно определить источник получения культуры, морфологические и культуральные свойства, окраски по Граму или Романовскому-Гимзе. Для установления рода, вида и особенно варианта приходится применять определение биохимических, серологических, экологических признаков. Схемы идентификации микробов существенно различаются. Так, в идентификации бактерии акцент делают на биохимические и серологические свойства, грибов и простейших - на морфологические особенности клеток и колоний. При идентификации вирусов используют метод молекулярной гибридизации для установления специфичности генома, а также специальные серологические реакции.

Биохимическая идентификация чистой культуры бактерий проводится с помощью дифференциально-диагностических сред. Дифференциально-диагностические среды содержат субстрат для какого-либо фермента, выявляемого у микроба, и индикатор, фиксирующий изменение рН питательной среды и окрашивающий ее в цвета, характерные для кислых или щелочных значений рН (рис.2.1).

Рис.2.1. Пример биохимической (ферментативной) активности представителей семейства энтеробактерий. В среды добавлен индикатор - бромфеноловый синий, при нейтральных значениях рН среда имеет травянисто-зеленый цвет, при кислых значениях - жёлтый, при щелочных значениях рН - синий. Индол - щелочной продукт, наличие уреазы сопровождается образованием мочевины (щелочные значения рН), ферментация углеводов сопровождается образованием кислоты. Положительная проба на сероводород сопровождается почернением среды вследствие действия специального реактива

Серологическая идентификация подразумевает определение антигенной специфичности исследуемой культуры микробов и антигенной формулы - символического отображение антигенной структуры бактерий. Например, антигенную структуру S. typhi обозначают как O9,12:Vi:Hd; одного из сероваров E. coli - как O111:K58:H2. Антигенную формулу определяют в реакции агглютинации на стекле с помощью набора монорецепторных антисывороток, т.е. антител к определенным антигенам бактерий. В качестве исследуемых антигенов используют выращенную культуру бактерий, каждый микроб представляет собой корпускулярный антиген, дающий феномен агглютинации при добавлении специфичных ему антител. Некоторые проблемы возникают при исследовании капсульных бактерий: капсула экранирует соматический антиген, поэтому для исследования его бактериальную культуру прогревают. Высокая температура способствует разрушению термолабильной капсулы и О-антиген становится доступным для типирования. Техника постановки реакции агглютинации на стекле . На чистое обезжиренное стекло наносят каплю физ.раствора (контроль) и каплю антисыворотки. Если антисывороток несколько, то берут несколько стекол. В каждую каплю вносят с помощью бактериальной петли культуру микробов. В течение 1-3 мин наблюдают за появление агглютинатов, которые образуются при специфическом связывании определенных антител с бактериальными антигенами и их последующим объединением в крупные видимые глазом хлопья.